跟着越来越多耐药菌株的出现和新疾病的发生，东谈主类急需大齐的新药来冒失这种危急和挑战。固然咫尺临床上使用的抗生素的60%开端于链霉菌，但跟着测序时期的快速发展和大齐链霉菌基因组的序列分析，东谈主们发现链霉菌基因组中所含有的次级代谢家具生物合成基因簇的数目宏大于也曾论说其家具结构的次级代谢家具合成基因簇。这些在践诺室条目下不抒发或其家具难以被检测到的基因簇，被称为隐性基因簇。激活这些自然存在的隐性基因簇，是获取新式抗生素的紧迫妙技。咫尺微生物开端的一万多种自然抗生素只占到了当然界中可能存在的抗生素总量的一丝部分[1-2]。激活隐性基因簇的表率有多种[3]，其中对调控基因的遗传操作是最为平直和灵验的。调控基因在抗生素的生物合成中起到了一个开关的作用，它可决定一种抗生素生物合成的肇端与驱逐的密致调控历程。其中正调控基因的高效抒发不但不错激活联系隐性基因簇的抒发，况且还可擢升抗生素的产量[4-5]。同期，负调控基因的敲除不错使联系隐性基因簇淹没阻挠而抒发av 女同，同期也可使联系抗生素产量擢升[6]。因此，调控基因在抗生素生物合成中的作用仍然是值得温雅和发展的磋议课题。
链霉菌具有复杂的发育分化周期，要害历程之一即气生菌丝分隔酿成孢子链并开释出游离孢子。若是该历程中联系基因被阻断，链霉菌就不成平时发育分化酿成灰色的练习孢子而只可酿成白色的气生菌丝。此历程是由多个基因边界的，这些基因被定名为whi基因[7-8]。其中whiB算作发育调控联系基因启程点在天蓝色链霉菌中被发现[9]，通过基因组序列分析标明在链霉菌中大齐存在访佛于whiB的基因(whiB-like，wbl)如wblA，况且这一类基因只存在于放线菌中[7-9]。wblA的破损或缺失不仅梗概导致链霉菌酿成白色表型，况且擢升了放线紫红素(actinorhodin, Act)、十一烷基灵菌红素(undecylprodigiosin)、阿霉素(doxorubicin)、tautomycetin和默诺霉素(moenomycin)的产量[9-12]。而在恰塔努链霉菌(Streptomyces chattanoogensis L10)中，wblA的破损则导致纳他霉素(natamycin)不成合成[13]。通过与天蓝色链霉菌的序列比对，发咫尺圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)的基因组中存在一个和whiB访佛的基因，且它编码的卵白和天蓝色链霉菌中的WblA的序列同源性颠倒高(一致性为96%)，因此这个基因也被定名为wblA[14]。为了磋议圈卷产色链霉菌中wblA的功能，咱们通过同源双交换获取了wblA阻断突变株。通过表型不雅察、活性检测以及HPLC分析，揭示了wblA阻断突变导致尼可霉素(nikkomycin)不成产生，而激活了一种隐性抗生素的合成。质谱和核磁共振分析阐发，得到的三种新化合物的化学结构与泰乐菌素的结构访佛。抑菌活性检测效果标明，这3个化合物对肺炎链球菌的抑菌活性比泰乐菌素高10倍掌握[15]。
为了论说wblA突变激活基因簇抒发的分子机制，通过使用RNA-seq[16]和DACA (DNA affinity capture assay)表率[17]，发现与野生型(wild-type, WT)菌株比拟，在ΔwblA突变株中有好多基因判辨地出现转录上长入下调，其中san7324基因在朝生型菌株中可平时转录，而在突变株ΔwblA中不成转录。同期发现圈卷产色链霉菌基因组上还存在一个与san7324同源性较高的基因san7324L(一致性为72%)[17]。在上述责任的基础上，本文通过对san7324和san7324L基因的阻断突变磋议它们在形态分化和尼可霉素生物合成中的功能，为论说多效调控基因wblA作用的分子机制提供紧迫依据。
1 材料和表率 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒: 圈卷产色链霉菌7100 (S. ansochromogenes 7100)作念为本磋议的主要磋议材料，为本践诺室保存；白色念珠菌(Candida albicans)用于尼可霉素生物活性检测指点菌，为本践诺室保存；用于基因遗传操作的大肠杆菌ET12567/pUZ8002 (dam- dcm- hsdM-)和JM109 (recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，Δ(lac-proAB)/F’[traD36，proAB+lacIq，lacZΔM15])均为本践诺室保存；大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pKC1139 (Aprr)，含有链霉菌温度明锐pSG5复制子，用于基因破损；pSET152 (Aprr)，链霉菌整合型质粒，用于基因互补；pSJ101，pKC1139生息质粒，用于san7324阻断；pSJ102，pKC1139生息质粒，用于san7324L阻断。 1.1.2 培养基和培养条目: 培养大肠杆菌使用LB培养基，培养圈卷产色链霉菌使用MS培养基、YEME培养基和MM[15, 18](甘霖醇为惟一碳源)培养基。尼可霉素发酵培养基使用SP[15, 18]。培养白色念珠菌的是PDA(取去皮的土豆100 g，加900 mL蒸馏水，煮沸15-20 min，四层纱布过滤，滤液中加入10 g葡萄糖，并定容至1000 mL。固体PDA培养基中加入1%的琼脂)培养基。大肠杆菌的培养温度为37 ℃，链霉菌的培养温度为28 ℃，白色念珠菌在固体PDA培养基上28 ℃培养5 d，而在37 ℃时，过夜培养即可[15]。 1.1.3 引物: 本文所用引物齐由Thermo Fisher Scientific试剂公司合成，引物序列见表 1。 开心情色网 1.1.4 抗生素、酶及试剂: 卡那霉素(100 mg/mL H2O)，安普霉素(100 mg/mL H2O)，氯霉素(25 mg/mL 100%酒精)，萘啶酮酸(100 mg/mL 0.1 mol/L NaOH)算作储备液于-20 ℃保存。在LB培养基中，卡那霉素、安普霉素的使用浓度齐为100 μg/mL，氯霉素为25 μg/mL，萘啶酮酸在MS中的使用浓度是25 μg/mL，卡那霉素和安普霉素在MS培养基、YEME培养基和MM培养基中的使用浓度均为5 μg/mL，X-gal和IPTG用于大肠杆菌转机子的筛选，使用浓度为40 μg/mL。践诺中所用到的各式截至性内切酶购自TaKaRa和NEB公司；高保真KOD-plus DNA团员酶购自TOYOBO公司；T4 DNA ligase购自Thermo Fisher Scientific公司；用于RNA索求的Trizol试剂购自Invitrongen公司；用于RNA索求的试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；荧光定量RT-PCR试剂2×SuperReal PreMix购自天根生化科技有限公司；DNA沾污排除试剂购自普利莱基因时期有限公司；甲醇、乙腈以及回转录所用Maxima RNA回转录酶和RNase扼制剂购自Thermo Fisher Scientific公司；庚烷磺酸钠和己烷磺酸钠购自Fisher Chemical公司。 1.2 DNA基本操作与分析微生物学和分子生物学基本操作参照分子克隆践诺指南[19]，链霉菌基因组的索求参照链霉菌遗传操作手册[18]。
1.3 基因阻断突变株的构建为了构建san7324阻断突变株，率先用引物san7324-up-F/R和san7324-dn-F/R(表 1)对圈卷产色链霉菌7100基因组DNA分歧进行PCR扩增得到两段均为2.0 kb同源臂片断，得到的这两个同源臂片断中除含有部分san7324的片断外，还含有san7324两侧的其他基因，同期分歧用Xba Ⅰ/ BamH Ⅰ和BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切，贯穿在被Xba Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切后的温度明锐型质粒pKC1139上，得到的重组质粒定名为pSJ101。给与一样的载体构建战略，对san7324L(圈卷产色链霉菌中的san7324同源基因，氨基酸序列一致性为72%)阻断突变株进行了构建，得到的重组质粒定名为pSJ102，所构建的质粒均由Thermo fisher Scientific公司进行了测序。参照链霉菌遗传手册中的表率通过同源双交换的战略分歧获取了san7324和san7324L的阻断突变株Δsan7324和Δsan7324L。同期在PCR扩增考证正确的突变株Δsan7324中敲除了san7324L，获取双基因阻断突变株Δsan7324-san7324L，并通过引物san7324L-F和san7324L-R进行了PCR考证。
1.4 阻断突变株的表型和形态不雅察把圈卷产色链霉菌野生型菌株和双基因阻断突变株分歧接种在MS、MM[15, 18](甘霖醇为碳源)固体培养基的名义，在28 ℃条目下培养，在不同的培养时刻通过肉眼和扫描电子显微镜分歧不雅察基质菌丝、气生菌丝、孢子链酿成及色素产生的表型和形态特征，用扫描电子显微镜不雅察菌丝体和孢子链时，放大倍数为5000倍。
1.5 尼可霉素的HPLC分析和生物活性检测将野生型和突变株的孢子分歧接种到YEME液体培养基中，在28 ℃摇床(220 r/min)中培养48 h算作种子液。将0.5 mL(1% V/V)种子液加入到装有50 mL SP液体培养基的摇瓶中，在28 ℃摇床(200 r/min)中培养5 d后离心获取发酵液，然后用微孔膜(0.2 μm)过滤，得到的滤液用高效液相色谱法(HPLC)分析尼可霉素在290 nm处的紫外招揽波长[20]。以白色念珠菌算作尼可霉素生物活性检测指点菌，具体操作才能参照文件[21]。
1.6 基因的转录分析网罗发酵培养24、48 h的菌体索求总RNA，具体操作才能参照文件[4, 22]表率。cDNA合成以及及时荧光定量PCR(qRT-PCR)的操作参照文件[22]表率进行。
2 效果和分析 2.1 san7324阻断突变株的构建及考证将构建好的重组质粒pSJ101转机到大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞中，通过接合出动将该质粒出动至圈卷产色链霉菌7100中，利用同源双交换的战略对san7324进行基因阻断(图 1-A)。通过安普霉素抗性筛选得到正确的接合子，28 ℃培养5 d后，制备孢子悬浮液，在含有安普霉素抗性的MS平板上分歧涂布104、105和106个孢子/皿，于40 ℃培养。由于pKC1139是温度明锐型载体，40 ℃时在链霉菌中不成自主复制，需通过同源单交换将其同源序列重组整合到染色体上。接下来将筛选正确的单交换子涂布于无抗平板上于28 ℃传代2次，此时温度裁汰，同源臂发生第二次单交换同期佩带安普抗性的pKC1139在此历程中丢失。将稀释后助长出的多个单菌落分歧先后涂布在安普霉素抗性平板和无抗平板上，将AprS且无抗板助长的菌落进行PCR筛选得到阻断突变株Δsan7324。获取阻断突变株Δsan7324后，用引物san7324-ex-F和san7324-ex-R进行PCR考证，效果暴露以野生型基因组DNA为模板进行PCR扩增所获取的条带大小为888 bp，而以Δsan7324基因组DNA为模板进行PCR扩增所获取的条带大小为527 bp，比野生型相对应的条带小了361 bp，与预期效果一致，标明获取了正确的基因阻断突变株Δsan7324(图 1-B)。
2.2 san7324和san7324L双阻断对圈卷产色链霉菌形态分化的影响同源比对发现圈卷产色链霉菌中存在一个与san7324同源性较高的基因san7324L。给与疏通的同源双交换战略将敲除载体pSJ102导入到突变株Δsan7324中，按照上述才能阻断san7324L，并通过引物san7324L-F和san7324L-R对Δsan7324和双基因突变株进行了PCR考证，效果暴露以双基因突变株Δsan7324-san7324L的基因组DNA为模板进行的PCR扩增家具比突变株Δsan7324中的小了546 bp，与预期效果一致，由此获取了正确的双基因阻断突变株Δsan7324-san7324L(图 2)。
在以甘霖醇为碳源的MS培养基上培养菌株，由于野生型梗概产生练习的孢子而呈现灰色表型，单基因阻断突变株Δsan7324和Δsan7324L的形态分化并莫得受到影响，而双突变株Δsan7324-san7324L不成产生灰色孢子况且助长寥落，即使在蔓延培养时刻的条目下也只可酿成白色表型的气生菌丝(图 3-A)，与野生型菌株7100比较，Δsan7324-san7324L在固体培养基上产生了热枕更深扩散性更好的棕色色素(图 3-A，B)。同期对疏通培养条目下的野生型菌株7100和Δsan7324-san7324L进行了扫描电镜不雅察(放大倍数为5000倍)，效果标明野生型菌株能产生练习的孢子链(图 3-C)，而双突变株Δsan7324-san7324L不成产生孢子链或孢子，只可酿成长的气生菌丝(图 3-D)。此外，用san7324-san7324L回补双突变株(Δsan7324-san7324L)后，不错规复野生型的表型(效果未暴露)。
2.3 san7324和san7324L是尼可霉素生物合成的正调控基因圈卷产色链霉菌7100产生的尼可霉素是一种具有无为生物活性的核苷肽类抗生素[22]，在本践诺室也曾磋议多年，其要害结构基因的功能齐已被论说。将san7324的同源基因san7324L在圈卷产色链霉菌7100中进行了基因敲除，并通过高效液相色谱法(HPLC)和生物活性检测践诺分析了突变株Δsan7324、Δsan7324L和Δsan7324-san7324L产生尼可霉素的情况。将发酵液用HPLC分析，效果暴露，在紫外波长290 nm下，在朝生型和Δsan7324L菌株中均梗概了了地检测到尼可霉素Z和X的招揽峰，但Δsan7324L中尼可霉素的招揽峰比拟野生型有所裁汰，突变株Δsan7324和Δsan7324-san7324L中检测不到尼可霉素Z和X的招揽峰(图 4-A)。以白色念珠菌算作指点菌对发酵液进行了生物活性检测，效果暴露，野生型发酵液有判辨的抑菌圈，突变株Δsan7324L发酵液的抑菌圈较野生型小，而突变株Δsan7324和Δsan7324-san7324L的发酵液则莫得抑菌圈(图 4-B)，生物活性检测效果与HPLC分析效果一致。以上效果标明san7324单阻断、san7324和san7324L双阻断均导致尼可霉素不成被生物合成。
2.4 尼可霉素生物合成基因簇中联系基因的转录分析为了更进一步论说双突变株Δsan7324-san7324L对尼可霉素生物合成基因簇的影响，通过及时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析尼可霉素生物合成基因簇的转录情况。尼可霉素生物合成基因簇中有1个道路特异性正调控基因(sanG)和3个转录单位sanO-V、sanN-I和sanF-X。其中sanG是尼可霉素生物合成道路中最要害的正调控基因，而结构基因sanO、sanN和sanF分歧是3个转录单位中的第一个基因，因此这3个基因的转录情况可代表 3个转录单位的转录情况。以23S rRNA的编码基因算作内参基因进行的荧光定量PCR效果暴露，sanG、sanO和sanN在Δsan7324-san7324L中的转录受到了很大影响。其中在24 h和48 h时，Δsan7324-san7324L中sanG的转录比野生型中的转录水平均裁汰了1倍之多，而sanO和sanN的转录水平在24 h时比野生型而言也分歧有近1.5倍和4倍掌握的裁汰(图 5-A，B，C)。此外，Δsan7324-san7324L和野生型中的sanF的转录水平莫得显赫互异(图 5-D)。上述效果标明san7324-san7324L阻断主要影响了尼可霉素生物合成道路特异性正调控基因sanG和结构基因sanO-V与sanN-I的转录。
3 商议链霉菌因具有复杂的发育分化周期和无与伦比的合成繁密次级代谢家具的身手而被东谈主们所醉心。WblA是放线菌发育分化和次级代谢家具生物合成中无为存在的一种全局性或多效性调控卵白，不同链霉菌种间WblA的序列一致性达到95%以上，其含有4个保守的半胱氨酸残基可酿成氧化明锐的[4Fe-4S]结构。对其编码基因进行遗传操作，是激活隐性基因簇发现新化合物的灵验妙技。WblA率先在1992年由Chater等在天蓝色链霉菌中发现[8]。2007年Kim等通过DNA microarray和高抒发的花式，详情了wblA是放线紫红素和阿霉素生物合成基因簇的负调控基因[23]。在2011年，Chater等对天蓝色链霉菌中的多个wbl基因(wblA，wblC，wblE，wblH，wblI，wblJ，wblK，wblL和wblM)进行了破损[9]，效果暴露只须wblA的破损梗概影响次级代谢家具的产量，这与Kim等的践诺相吻合。到咫尺为止，除圈卷产色链霉菌wblA突变株中被激活的泰乐菌素访佛物外，在Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66中，wblA突变可激活隐性α-吡喃酮类化合物violapyrone B (VLP B)的合成[24]，同期wblA在多株链霉菌中齐算作负调控基因而存在[10-11]，但浙江大学李永泉教育践诺室则发现wblA在恰塔努链霉菌中对纳他霉素的生物合成起到了正调控的作用[13]，敲除wblA导致纳他霉素不成合成。中国科学院微生物磋议所谭华荣磋议员践诺室对圈卷产色链霉菌中的wblA敲除后，导致尼可霉素不成合成，况且激活了泰乐菌素访佛物生物合成基因簇[15]。与之前的报谈不同[9, 23]，圈卷产色链霉菌中wblA的敲除导致菌体不成产生灰色孢子而呈现白色表型[15]，认知WblA不但算作次级代谢家具生物合成的调控因子，况且也在发育分化调控中饰演了紧迫变装，是一个访佛于AdpA的多效调控子[13]。
到咫尺为止，关联WblA调控卵白平直的靶基因还莫得任何报谈。固然之前本践诺室通过对圈卷产色链霉菌7100及wblA突变株进行RNA-seq分析，得到了大齐转录受WblA影响的基因，但通过EMSA践诺未能检测到WblA与靶基因开动子区的研讨。推断是由于WblA氧化明锐的[4Fe-4S]结构使得该卵白在体外被氧化而失去了DNA研讨活性[25]。Bush等最新磋议发现，在委内瑞拉链霉菌中WhiB与WhiA酿成异源二聚体，对卑鄙靶基因运用调控作用，单独的WhiB卵白不成与靶基因开动子区研讨[25]。WblA与WhiB氨基酸序列一致性为50%，不扬弃WblA与其他卵白酿成异源复合物进而推崇调控作用的可能。在圈卷产色链霉菌中对whiA进行缺失突变后发现whiA突变株仍然产生尼可霉素，因此扬弃了WblA与WhiA酿成异源二聚体的可能性。
由本践诺室之前的效果[15, 17]可知，尼可霉素产量变化与其生物合成基因在wblA突变株中的转录变化基本一致。在∆wblA中，咱们发现san7324不转录。在∆san7324中，尼可霉素不再产生。推断WblA可能通过激活san7324的转录曲折地激活了尼可霉素的生物合成[17]。但在∆san7324中av 女同，在尼可霉素不再合成的情况下，泰乐菌素访佛物的合成并未被激活。为此，咱们推断野生型圈卷产色链霉菌中可能存在与san7324同源的其他基因，在san7324缺失突变后，仍然可扼制泰乐菌素访佛物的生物合成。咱们进一步通过基因组数据库的分析发现圈卷产色链霉菌7100中如实存在san7324同源基因san7324L[17]，二者编码的氨基酸序列一致性(identity)达到72%，且与san7324访佛，在∆wblA中san7324L基本上也不转录。本磋议进行了san7324和san7324L双基因阻断突变菌株∆san7324-san7324L的构建，效果揭示该突变株在不成产生尼可霉素的同期也不成分化酿成灰色的练习孢子，在蔓延培养条目的情况下仍然保捏白色气生菌丝的表型。但与咱们所生机的不同的是在双突变株中未检测到泰乐菌素访佛物的产生。在畴前的责任中，可进一步尝试给与不同培养基对∆san7324-san7324L进行发酵，检测该双突变株中泰乐菌素访佛物是否在某些养分条目下不错合成。本践诺室早期效果标明sanG基因的阻断导致尼可霉素不成生物合成，同期也不成平时发育分化酿成灰色的练习孢子链，只可酿成白色的气生菌丝[4]。因此，san7324-san7324L双基因阻断导致的效果与sanG阻断的效果是一致的，从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素合成。但是san7324-san7324L与sanG基因之间是怎样的调控关系，调控的机制是什么？尚需进一步潜入磋议。上述磋议为论说链霉菌中无为存在的多效调控基因wblA在抗生素生物合成和形态分化中作用的分子机制，为繁密隐性次级代谢家具生物合成基因簇激活和得到新式抗生素提供紧迫的依据。